Firmas de ARNm exosomal circulante para el diagnóstico precoz del carcinoma de células renales de células claras

BMC Medicine volumen 20, Número de artículo: 270 (2022) Citar este artículo

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Hasta el momento, no existen biomarcadores tumorales comprobados para el diagnóstico temprano del carcinoma de células renales de células claras (ccRCC). Este estudio tuvo como objetivo identificar nuevos biomarcadores de ccRCC basados en perfiles de ARNm exosomal (ARNm) y desarrollar firmas basadas en ARNm para la detección temprana de ccRCC.

Se reclutaron 488 participantes, incluidos 226 ccRCC localizados, 73 pacientes con masas renales benignas y 189 controles sanos. La secuenciación del ARNm circulante se realizó en 12 ccRCC y 22 controles sanos en la fase de descubrimiento. Los ARNm candidatos se evaluaron con 108 ccRCC y 70 controles sanos en las fases de prueba y entrenamiento. Las firmas basadas en ARNm se desarrollaron mediante análisis de regresión logística y se validaron con cohortes adicionales de 106 ccRCC, 97 controles sanos y 73 individuos benignos.

Se identificaron cinco ARNm, CUL9, KMT2D, PBRM1, PREX2 y SETD2, como nuevos biomarcadores potenciales de ccRCC. Además, desarrollamos una firma de diagnóstico temprano que comprendía KMT2D y PREX2 y una firma de diagnóstico diferencial que comprendía CUL9, KMT2D y PREX2 para la detección de RCC. La firma de diagnóstico temprano mostró una alta precisión para distinguir los ccRCC de los controles sanos, con áreas bajo la curva característica operativa del receptor (AUC) de 0,836 y 0,830 en las cohortes de entrenamiento y validación, respectivamente. La firma de diagnóstico diferencial también mostró un gran rendimiento en la distinción de ccRCC de masas renales benignas (AUC = 0,816), incluidas masas sólidas (AUC = 0,810) y masas quísticas (AUC = 0,832).

Establecimos y validamos nuevas firmas basadas en ARNm para la detección temprana de ccRCC y el diagnóstico diferencial de masas renales inciertas. Estas firmas podrían ser biomarcadores prometedores y no invasivos para la detección de ccRCC y, por lo tanto, mejorar el pronóstico de los pacientes con ccRCC.

1. La secuenciación del ARN exosomal circulante identificó nuevos biomarcadores potenciales del carcinoma de células renales de células claras (ccRCC).

2. La firma de diagnóstico temprano que comprende KMT2D y PREX2 mostró una alta precisión en la distinción de ccRCC de individuos sanos.

3. La firma de diagnóstico diferencial que comprende CUL9, KMT2D y PREX2 mostró un gran rendimiento en la distinción de ccRCC de masas renales benignas.

4. Estas firmas podrían ser biomarcadores prometedores y no invasivos para la detección de ccRCC.

Informes de revisión por pares

El carcinoma de células renales (CCR) se origina a partir de las células epiteliales tubulares renales y representa más del 90% de los tumores renales malignos [1]. La incidencia de CCR está aumentando constantemente en todo el mundo, con una tasa de aumento más alta en los países en desarrollo y una tasa de incidencia más alta en los países desarrollados [2]. El CCR temprano está confinado al órgano con una tasa de supervivencia a 5 años de más del 90%. Sin embargo, una vez que el CCR invade órganos locales o se disemina a distancia, el tratamiento del tumor es bastante complejo y el pronóstico es malo [3]. El RCC de células claras (ccRCC) es el subtipo más común y representa aproximadamente el 75% de los RCC recién diagnosticados [1]. Por lo tanto, la detección temprana precisa de ccRCC es de gran importancia para el manejo de RCC. Desafortunadamente, hasta el momento no existen biomarcadores tumorales comprobados para el diagnóstico temprano de ccRCC.

Los exosomas son pequeñas vesículas extracelulares de 40 a 150 nm de diámetro secretadas por células que contienen moléculas como ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, aminoácidos y metabolitos, y juegan un papel importante en la comunicación celular y en la regulación de los procesos fisiológicos y patológicos del cuerpo humano [4]. Más importante aún, la estructura de la membrana de bicapa lipídica de los exosomas es resistente al efecto de las proteasas exógenas y las enzimas de ARN, lo que da lugar a sustancias más estables, como los ARN mensajeros (ARNm), los microARN (miARN) y las proteínas funcionales [5, 6]. Los exosomas derivados de tumores que llevan varias moléculas podrían proporcionar un método no invasivo prometedor para detectar cánceres [7].

Recientemente, informes emergentes han indicado que los ARN exosómicos circulantes (exARN) pueden servir como biomarcadores prometedores para la detección del cáncer [8,9,10]. Los estudios han demostrado que los miARN exosómicos en la sangre y la orina podrían discriminar eficazmente el carcinoma de células renales de los controles sanos, lo que sugiere que los miARN exosómicos podrían usarse como biomarcadores para detectar el RCC [11, 12]. Debido a la amplia adopción de la secuenciación de ARN pequeño por parte de los grupos ERCC1 y la exploración reciente de los investigadores, se han examinado otros biotipos de ARN, especialmente los ARN largos [13]. Estudios recientes han demostrado que los ARN largos de vesículas extracelulares (exLR), principalmente ARNm, podrían ser biomarcadores potenciales para el cáncer de próstata (PCa) [14], glioma [15], carcinoma hepatocelular (HCC) [16, 17], adenocarcinoma ductal pancreático ( PDAC) [18], etc. Aunque se han publicado algunos estudios preliminares que intentan identificar los ARNm para detectar ccRCC, su rendimiento clínico se ha visto limitado en gran medida debido al diseño del estudio (es decir, tamaño de muestra pequeño [19], falta de un verdadero negativo control [19], y falta de validación en muestras clínicas [20]).

En este estudio, investigamos sistemáticamente el perfil de ARNm exosomal (ARNm) circulante mediante secuenciación de ARN entre ccRCC localizados y controles sanos y encontramos una serie de ARNm asociados con ccRCC. Luego identificamos y validamos varios ARNm con potencial de diagnóstico en una gran cohorte de 488 participantes. Finalmente, establecimos firmas basadas en ARNm para el diagnóstico temprano de ccRCC.

Las características demográficas y clínicas de las cohortes de descubrimiento, prueba, entrenamiento y validación de los participantes se presentan en la Tabla 1 y en el Archivo adicional 2: Tabla S1. No hubo diferencias significativas en la distribución de sexo y edad entre los ccRCC localizados y los controles sanos en las cohortes de participantes de descubrimiento, prueba, entrenamiento y validación (Tabla 1). Para los participantes en el grupo de ccRCC y los pacientes con masas benignas en la cohorte de validación, la distribución de edad entre los ccRCC y los controles benignos fue similar. Los tamaños tumorales iniciales medios fueron inferiores a 4 cm en cuatro cohortes de ccRCC localizados. Los estadios clínicos del tumor fueron T1-2 en cuatro cohortes de ccRCC localizados. En la gran mayoría de los casos de ccRCC, el grado patológico fue G1-2 (83,3 % en la cohorte de descubrimiento, 93,8 % en la cohorte de prueba, 88,0 % en la cohorte de entrenamiento, 96,2 % en la cohorte de validación). Las características demográficas y clínicas de los participantes con el grupo de masas quísticas y sólidas benignas se presentan en el archivo adicional 2: Tabla S1. Hubo menos participantes masculinos en el grupo sólido, y los participantes en el grupo sólido eran más jóvenes que los del grupo quístico y el grupo ccRCC. Los tamaños de los tumores fueron mayores en el grupo quístico que en el grupo sólido.

En la fase de descubrimiento, investigamos el perfil de ARNm circulante entre 12 ccRCC localizados (n = 12) y controles sanos (n = 22) por RNA-seq. Luego, según los datos de secuenciación del ARN, se identificaron 210 ARNm desregulados (p < 0,05, cambio de veces > 2 o < 0,5, FDR < 0,05, archivo adicional 2: tabla S3). El mapa de calor ilustró los niveles de expresión de los ARNm asociados con ccRCC representativos (archivo adicional 1: Fig. S2A). Siete ARNm regulados al alza y relacionados con ccRCC o múltiples tumores malignos, incluidos CUL9, ATM, ARID1A, KMT2D, PBRM1, PREX2 y SETD2, se seleccionaron como biomarcadores candidatos para realizar más pruebas. Luego, probamos los niveles de expresión de estos siete ARNm candidatos por RT-qPCR en una cohorte adicional de ccRCC localizados (n = 16) y controles sanos (n = 20). Se excluyeron ATM y ARID1A porque no mostraron diferencias entre el grupo ccRCC y el grupo sano (Archivo adicional 1: Fig. S2B). Finalmente, los 5 ARNm restantes (CUL9, KMT2D, PBRM1, PREX2 y SETD2) que estaban regulados al alza en los ccRCC se incluyeron para entrenamiento y validación (Archivo adicional 1: Fig. S2B).

En la fase de entrenamiento, los niveles de expresión de los ARNm se detectaron en una cohorte adicional de 142 muestras clínicas, incluidos ccRCC localizados (n = 92) y controles sanos (n = 50), mediante RT-qPCR, lo que reveló que CUL9, KMT2D, PBRM1, PREX2 y SETD2 fueron significativamente más altos en el grupo ccRCC que en el grupo sano, y cada uno de los biomarcadores candidatos logró un buen rendimiento para distinguir los ccRCC localizados de los controles sanos con AUC correspondientes de 0,611, 0,668, 0,639, 0,742 y 0,680. respectivamente (Tabla 2, Fig. 1A y Archivo adicional 1: Fig. S3A). Además, KMT2D y PREX2 se identificaron además como biomarcadores significativos para el diagnóstico de ccRCC mediante análisis de regresión logística multivariable (Tabla 2). Estos dos ARNm se validaron luego en una cohorte adicional de ccRCC localizados (n = 106) y controles sanos (n = 97). Se observaron altos niveles de expresión de KMT2D y PREX2 en el grupo ccRCC en comparación con el grupo sano (Fig. 1B). La precisión diagnóstica de KMT2D y PREX2 tuvo AUC de 0,655 y 0,776, respectivamente (Tabla 2, Archivo adicional 1: Fig. S3B). Después del análisis de regresión logística multivariable, KMT2D y PREX2 aún mostraban significación estadística para distinguir los ccRCC localizados de los controles (Tabla 2).

Validación de los ARNm circulantes asociados con ccRCC y establecimiento de una firma de diagnóstico temprano de carcinoma de células renales de células claras (ccRCC) basado en ARNm. A Gráficos de dispersión que muestran los niveles de expresión de los ARNm circulantes asociados con ccRCC, incluidos CUL9, KMT2D, PBRM1, PREX2 y SETD2, entre ccRCC localizados (n = 92) y controles sanos (n = 50) en la fase de entrenamiento. B Gráficos de dispersión que muestran los niveles de expresión de KMT2D y PREX2 identificados como biomarcadores significativos para el diagnóstico de ccRCC mediante análisis de regresión logística multivariable entre ccRCC localizados (n = 106) y controles sanos (n = 97) en la fase de validación. C, D La evaluación ROC-AUC mostró el rendimiento diagnóstico de la firma que comprende KMT2D y PREX2 para distinguir los ccRCC localizados de los controles sanos en la fase de entrenamiento (n = 142) y la fase de validación (n = 203). ccRCC, carcinoma de células renales de células claras; ROC, característica del operador del receptor; AUC, área bajo la curva

En las cohortes de entrenamiento (n = 142), usamos un análisis de regresión logística multivariable para establecer una firma ccRCC basada en ARNm que comprende KMT2D y PREX2. El rendimiento diagnóstico de la firma (logit (p = ccRCC) = 1,21943 × KMT2D + 1,97072 × PREX2 + 1,30485), medido por AUC, fue de 0,836 (p < 0,001; IC 95%, 0,765 a 0,893, fig. 1C). Los nuevos biomarcadores (KMT2D y PREX2) identificados a partir del conjunto de entrenamiento se aplicaron en la cohorte de participantes de validación (n = 203). Luego, estos genes se aplicaron al modelo anterior y se construyó el ROC. La firma de diagnóstico también mostró una alta precisión para distinguir los ccRCC de los controles sanos, con un área bajo la curva característica operativa del receptor (AUC) de 0,830 (p < 0,001; IC del 95 %, 0,771 a 0,879, fig. 1D). Estos resultados mostraron que la firma de ARNm podría servir como un método novedoso para la detección temprana de ccRCC a partir de controles sanos.

Es de gran importancia diagnosticar ccRCC a partir de una pequeña masa renal. Por lo tanto, recolectamos muestras adicionales de participantes con masas renales benignas (n = 73), incluidas masas sólidas (n = 47) y masas quísticas (n = 26), para evaluar el papel diagnóstico de los 5 ARNm candidatos, incluidos CUL9, KMT2D , PBRM1, PREX2 y SETD2, para distinguir los ccRCC de los pacientes con masas renales benignas. Primero evaluamos los niveles de expresión de los ARNm candidatos entre ccRCC y pacientes con masas renales benignas. Se observaron altos niveles de expresión de CUL9 y PREX2 en ccRCC en comparación con los de pacientes con masas renales benignas (Fig. 2A). El poder de diagnóstico de CUL9, KMT2D y PREX2 tuvo AUC de 0,619, 0,585 y 0,629, respectivamente (Tabla 3, Archivo adicional 1: Fig. S3C). Después del análisis de regresión logística multivariante, estos tres candidatos aún mostraron significación estadística para distinguir los ccRCC de pacientes con masas renales benignas con valores de p multivariados < 0,0001, < 0,0001 y 0,0001, respectivamente (Tabla 3). Para evaluar el rendimiento de la firma derivada para distinguir ccRCC de controles sanos en el diagnóstico diferenciado de masas renales, aplicamos la firma para diferenciar ccRCC de pacientes con masas renales benignas. Sin embargo, el rendimiento diagnóstico de la firma, evaluado por AUC, fue solo 0,559 (Archivo adicional 1: Fig. S4), lo que indica que la firma para detectar ccRCC de un control sano no era aplicable en el diagnóstico diferencial de masas renales. Luego usamos un análisis de regresión logística para establecer una firma de diagnóstico basada en ARNm usando CUL9, KMT2D y PREX2, logit (p = ccRCC) = 1.68689 × CUL9 - 1.16173 × KMT2D + 1.17881 × PREX2 + 0.75145. La firma mostró un gran rendimiento en el diagnóstico de ccRCC de pacientes con masas renales benignas (AUC = 0,816, p < 0,001; IC del 95 %, 0,751 a 0,870, fig. 2B). Además, la firma diagnóstica también mostró una excelente capacidad para distinguir ccRCC de masas sólidas benignas (AUC = 0,810, p < 0,001; IC del 95 %, 0,739 a 0,869, fig. 2C) y masas quísticas benignas (AUC = 0,832, p < 0,001). , IC del 95%, 0,757 a 0,891, Fig. 2D), respectivamente. Estos resultados indicaron que la firma de diagnóstico basada en ARNm podría ser un nuevo biomarcador no invasivo para mejorar el diagnóstico de ccRCC.

Establecimiento de una firma diagnóstica de carcinoma de células renales de células claras (ccRCC) basada en ARNm. A Gráficos de dispersión que muestran los niveles de expresión de los ARNm candidatos, incluidos CUL9, KMT2D, PBRM1, PREX2 y SETD2, entre ccRCC localizados (n = 106) y pacientes con masas renales benignas (n = 73). La evaluación B ROC-AUC mostró el rendimiento diagnóstico de la firma de diagnóstico que comprende CUL9, KMT2D y PREX2 para diferenciar ccRCC localizados (n = 106) de pacientes con masas renales benignas (n = 73). C, D La evaluación ROC-AUC mostró el rendimiento diagnóstico de la firma que comprende CUL9, KMT2D y PREX2 para diferenciar ccRCC localizados (n = 106) de pacientes con masas sólidas benignas (n = 47) y masas quísticas benignas (n = 26) . ccRCC, carcinoma de células renales de células claras; ROC, característica del operador del receptor; AUC, área bajo la curva

Como una de las neoplasias malignas urológicas más peligrosas, el ccRCC aún no cuenta con herramientas o estrategias de diagnóstico ideales. Un estudio de cohorte observacional prospectivo multicéntrico de 706 pacientes en el Reino Unido expuso la importancia de la detección temprana de CCR, lo que sugiere que centrarse en los síntomas relacionados con el CCR se limita a mejorar el diagnóstico temprano de CCR [21]. Se debe prestar más atención a la mejora de las estrategias de diagnóstico y la identificación de biomarcadores de diagnóstico.

Aproximadamente el 60% de los pacientes con CCR se diagnostican de forma incidental, y la mayoría de ellos se diagnostican mediante un examen de imagen [21]. El ultrasonido, como un examen relativamente económico, conveniente y seguro, puede detectar del 85 al 100 % de los tumores > 3 cm de tamaño, pero solo del 67 al 82 % de los tumores de 2 a 3 cm, lo que sugiere que puede haber más falsos. -resultados negativos en la detección de tumores < 3 cm de tamaño mediante ultrasonido [22]. Por otro lado, la tomografía computarizada (TC) y la resonancia magnética nuclear (RMN) son más sensibles y específicas que la ecografía para la detección de CCR. Sin embargo, debido a la baja rentabilidad y la dosis de radiación, es poco probable que la TC o la RM deban recomendarse para el cribado de la población [23]. Además, el examen de CT o MRI a menudo detecta otros hallazgos incidentales que pueden conducir a un sobrediagnóstico de una variedad de masas viscerales inciertas. Por lo tanto, se debe tener en cuenta la creación de una modalidad de detección rentable, precisa, factible y de bajo riesgo para ccRCC.

Actualmente, un número creciente de estudios se dedican al descubrimiento de biomarcadores de diagnóstico para ccRCC. Se han recomendado varios biomarcadores que se encuentran en suero y orina como nuevas herramientas de detección o diagnóstico que pueden diferenciar el CCR de tumores urológicos no renales, masas renales benignas y controles sanos [24]. Los investigadores encontraron que AQP1 y PLIN2 en orina estaban significativamente regulados al alza en pacientes con ccRCC y RCC papilar (n = 47), mostrando un alto potencial como biomarcadores de detección de RCC y una herramienta de diagnóstico diferencial para masas renales [25]. Sin embargo, debido al pequeño tamaño de la muestra, la orina AQP1 y PLIN2 deben validarse más. Otro grupo de investigadores desarrolló un ensayo de tres marcadores en suero/plasma compuesto por N-metiltransferasa (NNMT), L-plastina (LCP1) y proteína de células no metastásicas 1 (NM23A) para mejorar la detección temprana de RCC. El ensayo de tres marcadores tiene alta sensibilidad, especificidad y AUC diagnóstica (95,6 %, 90,9 % y 0,932) para CCR en comparación con controles sanos y tumores benignos, pero tiene una capacidad limitada para diferenciar CCR de masas renales benignas [26]. En general, la biopsia líquida de sangre u orina todavía tiene un gran potencial para mejorar la detección temprana y el diagnóstico diferencial del CCR.

Las características de los exosomas hacen que los ensayos relacionados con exosomas sean un método no invasivo y eficaz cada vez más destacado para el diagnóstico y seguimiento de enfermedades [8, 27]. El gran potencial de los exosomas en el diagnóstico y tratamiento se ha demostrado en varios tipos de cáncer, como el de próstata, vejiga y mama [28, 29]. Actualmente, los estudios han encontrado que los ARN exosómicos, especialmente los miARN, pueden tener un gran potencial en la detección de RCC [30]. Los niveles de MiR-21 fueron más altos en los ccRCC que en los controles sanos tanto en el suero como en los exosomas del suero. El miR-210 exosomal en suero podría distinguir efectivamente los ccRCC de los controles (AUC = 0.8779) [31]. Otro estudio encontró que miR-210 y miR-1233 exosomal en suero podrían ser nuevos biomarcadores para diagnosticar ccRCC [32]. Otros encontraron que hsa-mir-149-3p y hsa-mir-424-3p descubiertos por secuenciación de miARN exosomal tenían niveles de expresión más altos en RCC que en controles sanos [12]. Sin embargo, estos estudios previos se centraron en los miARN circulantes y todavía no hay estudios que exploren el papel potencial de los ARNm circulantes en la detección temprana de ccRCC. En este estudio, investigamos sistemáticamente el perfil de ARNm circulante mediante secuenciación de ARN entre ccRCC localizados y controles sanos y encontramos varios ARNm asociados con ccRCC. Luego identificamos 5 ARNm asociados con ccRCC con potencial de diagnóstico y establecimos una firma de detección basada en ARNm con gran capacidad para la detección de ccRCC. Esta firma podría servir como un nuevo biomarcador para descartar ccRCC de la población normal.

Con el uso generalizado de imágenes transversales, la incidencia de masas renales, especialmente masas renales pequeñas (SRM, diámetro < 4 cm), ha mostrado un aumento significativo [33]. Los SRM plantean la dificultad del diagnóstico diferencial. Se ha informado que el 20 % de las masas renales < 4 cm se identificaron como histología benigna, mientras que la proporción de histología benigna en aquellas ≥ 7 cm fue del 6,3 % [34]. Las masas renales se pueden dividir en masas sólidas, masas quísticas y masas inflamatorias [35]. La mayoría de los pacientes con masas renales son asintomáticos y la morfología principal de las masas es sólida y quística. La masa renal sólida benigna más frecuente en la práctica clínica es el angiomiolipoma (AML) [36, 37]. Sin embargo, casi el 5% de las LMA, llamadas LMA pobres en lípidos, tienen muy poca grasa para ser diagnosticadas por TC o RM [38, 39]. Por lo tanto, los AML pobres en lípidos son difíciles de distinguir del CCR, y algunos de estos tumores se diagnostican después de la cirugía [40]. El oncocitoma renal (RO) es una neoplasia epitelial benigna que generalmente contiene células grandes con citoplasma eosinofílico granular [41]. Sin embargo, la invasión de la grasa perirrenal se produce en el 2-20% de los casos de RO, y aproximadamente el 5,4% de los casos de RO muestran invasión vascular [42]. Estas características se consideran comúnmente una característica de malignidad en el CCR, lo que puede aumentar la dificultad del diagnóstico diferencial. Por otro lado, la mayoría de las masas quísticas renales son quísticas no neoplásicas, pero muchos tumores renales contienen quistes como componente menor o dominante; por lo tanto, es necesario el diagnóstico diferencial de masas quísticas renales benignas y malignas [43]. Para identificar ccRCC, es importante distinguir las masas malignas renales de las masas sólidas y quísticas benignas. El desarrollo de un método no invasivo de diagnóstico diferencial sigue siendo de gran valor potencial en la práctica clínica.

En nuestro estudio, recolectamos además el suero de 106 ccRCC y 73 pacientes con masas renales benignas y luego construimos una firma de diagnóstico de ccRCC con tres genes candidatos que fueron seleccionados mediante análisis de regresión logística paso a paso multivariado. Esta firma mostró una excelente capacidad para distinguir ccRCC de pacientes con masas renales benignas, ya sean sólidas o quísticas. Por lo tanto, las firmas diagnósticas podrían distinguir aquellos con una naturaleza incierta de las masas renales, como el carcinoma renal quístico, el angiomiolipoma pobre en grasa y el oncocitoma renal, especialmente si la masa era pequeña y la esencia del tumor no podía determinarse mediante imágenes.

Nuestro estudio también tuvo algunas limitaciones. En primer lugar, al ser un estudio retrospectivo de un solo centro, el tamaño de la muestra fue limitado. Los hallazgos, especialmente el rendimiento de la firma del ARNm para el diagnóstico de masas renales, deben validarse en un estudio prospectivo multicéntrico adicional a gran escala. En segundo lugar, debido a la insuficiencia de muestras para otros tipos de masas quísticas renales, nuestro estudio no pudo hacer un diagnóstico diferencial para las masas renales de grado Bosniak. Finalmente, este estudio se centró principalmente en la exploración de biomarcadores en sangre periférica adecuados para el diagnóstico precoz de tumores, pero no incluyó el análisis de factores clínicos como el tabaquismo, la obesidad, la hipertensión y otras variables, que podrían combinarse con características clínicas para establecer un modelo integral de diagnóstico y pronóstico de tumores en el estudio de seguimiento. Tampoco se realizaron experimentos celulares y animales, careciendo de cierto apoyo teórico, y el papel y el mecanismo de secreción del ARNm exosomal y RCC continuarán siendo explorados posteriormente.

Informamos una investigación sistemática de biomarcadores ccRCC utilizando el perfil de ARNm circulante por primera vez. Establecimos y validamos nuevas firmas basadas en ARNm para la detección temprana de ccRCC y el diagnóstico diferencial de masas renales inciertas. Estas firmas podrían ser biomarcadores prometedores y no invasivos para la detección de ccRCC y, por lo tanto, mejorar el pronóstico de los pacientes con ccRCC.

Este estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica del Hospital Shanghai Changhai (Shanghai, China) (n.º CHEC2020-112). Todas las muestras clínicas se obtuvieron del Hospital Shanghai Changhai. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los participantes antes del muestreo. En este estudio, 488 participantes, incluidos ccRCC localizados (n = 226), pacientes con masas renales benignas (n = 73) y controles sanos (n = 189), fueron reclutados consecutivamente desde agosto de 2017 hasta julio de 2020. Las masas renales fueron confirmado por patología quirúrgica y examinado por dos patólogos independientes. El estadio tumoral y el grado patológico se estimaron según los criterios 8.º TNM propuestos por el American Joint Committee on Cancer (AJCC) en 2017. Los criterios de inclusión para pacientes con masas renales fueron los siguientes: (1) edad entre 20 y 80 años; (2) tomografías computarizadas antes de la cirugía; (3) un diagnóstico definitivo por patología; (4) participantes de ccRCC con estadios tumorales clínicos I y II (carcinoma renal localizado); (5) recibió una operación quirúrgica, no se sometió a ningún tratamiento contra el cáncer antes del muestreo; (6) sin antecedentes de otros tipos de cáncer; y (7) consentimiento informado firmado. Los criterios de inclusión para los controles sanos fueron los siguientes: (1) edad de 20 a 80 años, (2) se sometió a un control de salud y se consideró asintomático y saludable, (3) el examen ultrasónico no mostró masa y (4) consentimiento informado firmado . Los criterios de exclusión fueron los siguientes: (1) masas renales previamente diagnosticadas, (2) recibieron terapia de ablación y (3) con otros tumores malignos.

Este estudio constó de cuatro fases: descubrimiento, prueba, entrenamiento y validación. Los participantes en las fases de descubrimiento, entrenamiento y validación se inscribieron consecutivamente y se asignaron aleatoriamente a estos grupos. Los participantes en la fase de prueba fueron seleccionados aleatoriamente de la fase de entrenamiento. Una descripción general del flujo de trabajo se resume en la Fig. 3. Las características clínicas de los participantes se resumen en la Tabla 1. En la fase de descubrimiento, investigamos el perfil de ARNm circulante en ccRCC (n = 12) y controles sanos (n = 22) por RNA-seq. Se identificaron ARNm desregulados (p < 0,05, cambio de pliegue > 2 o < 0,5, FDR < 0,05) en ccRCC. Los siete principales ARNm regulados al alza que también estaban relacionados con ccRCC o/y múltiples tumores malignos se seleccionaron como biomarcadores candidatos para capacitación y validación adicionales (ver detalles de 'La estrategia de selección de biomarcadores candidatos' en Archivo adicional 3: Información de respaldo). En la fase de prueba, los niveles de expresión de los ARNm candidatos se evaluaron en ccRCC localizados (n = 16) y controles sanos (n = 20) mediante RT-qPCR. En la fase de entrenamiento, los niveles de expresión de los ARNm significativos identificados en la fase de prueba se evaluaron en otra cohorte de ccRCC localizados (n = 92) y controles sanos (n = 50) mediante RT-qPCR. Se utilizó un análisis de regresión logística por pasos para identificar los predictores significativos y establecer una firma de ccRCC basada en ARNm para diferenciar los ccRCC de los controles sanos. Luego, la firma se validó en una cohorte adicional de ccRCC localizados (n = 106) y controles sanos (n = 97). Además, evaluamos el rendimiento diagnóstico de los ARNm candidatos para distinguir los ccRCC de los pacientes con masas renales benignas. En esta fase, se incluyeron pacientes con masas renales benignas (n = 73), incluidas masas renales sólidas (n = 47) y masas renales quísticas (n = 26) (las características clínicas detalladas se resumen en Archivo adicional 2: Tabla S1 ). Del mismo modo, aplicamos un análisis de regresión logística por pasos para identificar los predictores significativos y establecer una firma basada en el ARNm para diferenciar los ccRCC de los pacientes con masas renales benignas, incluidas las masas sólidas y quísticas.

Flujo de trabajo del diseño del estudio. ccRCC, carcinoma de células renales de células claras; RNA-seq, secuenciación de RNA; ARNm, ARN mensajero exosomal; PCR, reacción en cadena de la polimerasa

Los pacientes con masas renales firmaron el consentimiento informado el primer día de ingreso y la segunda mañana se les recogió sangre periférica en ayunas. Los controles sanos firmaron el consentimiento informado el día del control de salud y se les recolectó sangre periférica en ayunas antes del examen físico. Las muestras se almacenaron en un refrigerador a 4 °C y se transportaron al laboratorio con hielo. Las muestras de sangre se dejaron coagular a temperatura ambiente durante un mínimo de 30 min y un máximo de 2 h. A continuación, todas las muestras se centrifugaron a 1600 × g durante 15 min para separar el suero, y el suero (sobrenadante) se recogió en tubos de centrífuga de 1,5 ml y se numeró. Las muestras de suero se almacenaron inmediatamente a -80 °C hasta su posterior procesamiento.

Se usó un kit exoEasy Maxi (No. 76064, Qiagen, Dusseldorf, Renania del Norte-Westfalia, Alemania) para purificar los exosomas del suero de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Primero, el suero se filtró a través de una membrana de filtro de 0,22 μm, se agregó un volumen igual de tampón XBP y luego se invirtió suavemente y se mezcló 5 veces. Después de mezclar, la mezcla de muestra anterior se añadió a la columna de adsorción y se centrifugó a 500 × g durante 1 min a temperatura ambiente. La solución de flujo continuo se descartó de la columna de adsorción. Este procedimiento se repitió una vez. Luego, se agregaron aproximadamente 5 ml de tampón XWP a la columna de adsorción para su limpieza y se centrifugaron a 5000 × g durante 5 min a temperatura ambiente. La columna de adsorción se descartó y los exosomas de suero se inmovilizaron en la membrana de la columna de adsorción. Después de eso, la columna de adsorción se colocó en un nuevo tubo de recolección y se agregaron 400 μl de tampón XE a la columna para la elución, luego se incubó a temperatura ambiente durante 1 min y se centrifugó a 500 × g durante 5 min. Finalmente, el eluato en el tubo de recolección se volvió a agregar a la columna de adsorción y se incubó durante 1 min a temperatura ambiente. El eluato se centrifugó a 5000 × g durante 5 min y se transfirió a un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Los exosomas podrían usarse para investigaciones adicionales o almacenarse a -80 °C.

La muestra de exosoma purificada se diluyó 100 veces con PBS (SH30256.01, HyClone, Logan, UT, EE. UU.) y se usó para microscopía electrónica (JEM-1400, JEOL, Akishima, Tokio, Japón). Se pipeteó un total de 20 μl de la muestra diluida, se dejó caer al centro de una malla de cobre y se dejó reposar durante 20 min. Luego, el líquido se secó con papel de filtro para preparar la tinción negativa. La tinción negativa se realizó con ácido fosfotúngstico al 1% durante aproximadamente 10 s, y se utilizó papel de filtro para eliminar el exceso de líquido. Luego, se agregaron cuidadosamente 20 μl de ddH2O al centro de la malla de cobre y, después de 20 s, se aspiró el líquido restante de la malla con papel de filtro. La malla de cobre terminada estaba lista para la identificación de exosomas. TEM mostró la presencia de exosomas como estructuras redondeadas, en forma de disco bicóncavo, similares a vesículas (Archivo adicional 1: Fig. S1A).

Los exosomas extraídos se diluyeron 1:200 (PBS filtrado). El módulo detectado por el Nano Sight 300 (Malvern Instruments Ltd., Malvern, Reino Unido) se lavó con ddH2O 3 veces y luego se purgó con una jeringa bombeando aire de 7 a 8 veces para eliminar la mayor cantidad de líquido residual posible. Se aspiró un mililitro de la muestra de exosoma bien mezclada y diluida en el módulo con una jeringa y se expulsaron las burbujas de aire en la cámara de detección del módulo. El número de repeticiones de captura de imágenes se fijó en 3, y la duración de cada captura se fijó en 60 s. NTA mostró que los picos de exosomas circulantes de RCC, pacientes con masas benignas y controles sanos fueron de 74 nm, 77 nm y 79 nm, respectivamente, con un rango de 50 a 200 nm (Archivo adicional 1: Fig. S1B).

Se agregaron un total de 50 μl de tampón de lisis RIPA (P0013C, Beyotime, Shanghái, China) y 0,5 μl de inhibidor de proteasa a los exosomas extraídos. La mezcla se centrifugó a 15 000 × g durante 20 min a 4 °C. Se recolectó el sobrenadante y se midió la concentración usando un kit BCA (5,000,112, Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). A continuación, se añadió a las muestras un tampón de carga de 5 × (P0015, Beyotime, Shanghái, China). Estas muestras se incubaron en un baño metálico a 99 °C (Thermomixer comfort, Eppendorf, Hamburgo, Alemania) durante 15 min. Se usó un kit de preparación rápida de gel PAGE (PG112, EpiZyme, Shanghái, China) para preparar un pegamento separador al 10 % y un pegamento concentrado al 5 % de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, se agregaron muestras de proteína de exosoma de 30 μg a cada pozo y se agregaron 5 μl de marcador de proteína (P0077, Beyotime, Shanghái, China) al pozo en blanco. La máquina (165–8029, Bio–Rad, Hercules, CA, EE. UU.) se configuró a 120 V y se realizó electroforesis durante 2 h. Después de que se completó la electroforesis y se retiró el gel, se apiló con una membrana de PVDF (IPFL00010, Millipore, Burlington, MA, EE. UU.), se colocó en un tanque de transferencia y se llenó con tampón de transferencia. El instrumento se ajustó a 300 mA durante 2 h. Una vez completada la transferencia, las membranas se bloquearon con BSA al 5 % durante 2 ha temperatura ambiente y las membranas se cortaron en las posiciones apropiadas. Luego, anticuerpos contra CD9 (1:1000; AP1482D, ABGENT, Suzhou, Jiangsu, China), CD63 (1:500; AP5333B, ABGENT, Suzhou, Jiangsu, China), CD81 (1:4000; AM8557B, ABGENT, Suzhou, Jiangsu, China), TSG101 (1:2000; AM8662b, ABGENT, Suzhou, Jiangsu, China) y β-actina (1:5000; A5441, Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) y se incubaron a 4 ° C durante la noche. Al día siguiente, las membranas se colocaron a temperatura ambiente durante 15 min y se eliminó el anticuerpo primario. Las membranas se lavaron 6 veces con TBST durante 5 min cada vez. Luego, se agregaron los anticuerpos secundarios, se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente y se lavaron 6 veces con TBST durante 5 min cada vez. Se agregó el sustrato Clarity Max Western ECL (P0018 FS, Beyotime, Shanghái, China). Las transferencias fueron reflejadas por un dispositivo de imagen (e-Blot, Shanghái, China). WB mostró que los biomarcadores exosómicos, incluidos CD9, CD63, CD81 y TSG101, eran detectables en exosomas aislados (Archivo adicional 1: Fig. S1C).

El ARN exosomal circulante se purificó usando un exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit (217,084, Qiagen, Dusseldorf, Renania del Norte-Westfalia, Alemania). La secuenciación del ARN total utilizó de 0,25 a 50 ng de ARN como entrada. La eliminación de gDNA se realizó agregando HL-dsDNase (70 800–202, ArcticZymes, Tromsø, Noruega) y tampón de reacción (66 001, ArcticZymes, Tromsø, Noruega). Las bibliotecas para la secuenciación de ARN total se prepararon utilizando SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2-Pico Input Mammalian (634,413, Clontech, Mountain View, CA, EE. UU.). En comparación con el protocolo del fabricante, el paso de fragmentación se fijó en 2 min a 94 °C; de aquí en adelante, se siguió la opción de partir de ARN altamente degradado. La preparación de la biblioteca también incluyó la síntesis de ADNc, 5 ciclos de PCR de indexación, agotamiento de ADNc ribosómico y 9 a 16 ciclos de PCR de enriquecimiento. Se midió el tamaño de cada biblioteca con un kit de ADN de alta sensibilidad de Agilent (5067–4626, Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.) y la concentración con un kit de cuantificación de biblioteca (638,324, Clontech, Mountain View, CA, EE. UU.). Alternativamente, las bibliotecas se pueden cuantificar mediante un kit Qubit dsDNA HS (Q32854, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Las bibliotecas se combinaron en un grupo equimolar, cuyo tamaño y concentración se midieron, y las bibliotecas se secuenciaron utilizando la plataforma HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.). Para garantizar la calidad, se necesitaban datos sin procesar de 10 Gb por biblioteca.

Los datos de secuenciación fueron procesados por control de calidad por FastQC y recortados por Trimmomatic con los siguientes parámetros: longitud mínima 30, ventana deslizante 4 y calidad requerida 15. Luego, los datos limpios fueron mapeados al genoma humano de referencia (GRCh38.p13) por STAR con la base de datos de anotaciones de genes Ensembl release-95. Finalmente, usamos htseq para la cuantificación de la expresión y el paquete R Deseq2 para identificar los genes expresados diferencialmente entre diferentes grupos. Para reducir la tasa de falsos positivos de genes desregulados, realizamos múltiples pruebas de Benjamini-Hochberg para obtener un valor de p ajustado.

La validación de los productos de PCR se realizó mediante electroforesis en gel de ADN. Primero, se mezclaron 60 ml de TAE y 1 g de agarosa sólida y se calentaron hasta que se tornaron completamente transparentes. Cuando estaba tibio, se añadieron 6 µl de colorante de ácido nucleico, se agitó bien y se vertió en la rejilla para hacer cola. Los dientes del peine se insertaron hasta que se solidificaron por completo y luego se retiraron los dientes del peine. El gel de agarosa se colocó en el tanque de electroforesis, se agregó una solución de 1 × TAE hasta que el nivel del líquido estuvo por encima del gel y se descargaron las burbujas de aire en el pozo de muestra superior. Las muestras fueron cargadas. Las condiciones de electroforesis se establecieron típicamente a 120 V durante 30 min. Después de correr, se obtuvo una imagen del gel.

El ARN exosomal circulante se extrajo y purificó utilizando un exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit (217,084, Qiagen, Dusseldorf, Renania del Norte-Westfalia, Alemania). El ARN se transcribió inversamente en ADNc de acuerdo con las instrucciones del kit de reactivos PrimeScript™ RT (RR047A, Takara, Kioto, Japón). La operación debe realizarse en hielo, y el Master Mix debe prepararse en una cantidad que duplique el número de reacciones. Luego, se deben dispensar 10 µl en cada tubo de reacción. Las condiciones de la reacción de transcripción inversa fueron las siguientes: 37 °C durante 60 min, 85 °C durante 5 s y enfriamiento en hielo antes de su uso. El ADNc sintetizado podría usarse inmediatamente para qPCR posteriores o almacenarse temporalmente a -20 °C.

Los cebadores y las sondas se presentan en el archivo adicional 2: Tabla S2. Se utilizó un instrumento de PCR fluorescente ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Usando 20 μl del sistema qPCR, específicamente 10 μl de 2 × qPCR Master Mix y 2 μl de solución de cDNA, la concentración de trabajo de los cebadores aguas arriba y aguas abajo fue de 10 μM, las sondas se usaron a una concentración de 5 μM, y el la reacción se llevó hasta 20 μl con agua libre de ARNasa. El procedimiento de qPCR se estableció de la siguiente manera: 37 °C por 5 min, 95 °C por 10 min y 40 ciclos de 95 °C por 15 s y extensión a 59 °C por 1 min.

Aplicamos el método de cuantificación de curva estándar para la cuantificación de ARNm. Este método es similar a los enfoques anteriores utilizados para otros tipos de ARN [44]. Brevemente, sintetizamos los fragmentos amplificados de cada gen diana. Durante la transcripción inversa de estos genes, generamos una curva estándar utilizando PCR cuantitativa en tiempo real mediante la prueba de transcripciones sintetizadas en diferentes gradientes de concentración de número de copias. De esta manera, podríamos calcular el número de copias de los genes diana en relación con una muestra estándar. En concreto, se definió una cantidad inicial de 400 µl de suero para extraer el ARN de los exosomas. Luego, el ARN extraído se disolvió en agua libre de ARNasa. Luego, se procesaron 20 µl de ARNm para la transcripción inversa para producir 60 µl de ADNc. Luego, añadimos 2 µl de cDNA a 20 µl del sistema de PCR de fluorescencia, y se accedió a muestras por triplicado para obtener el valor medio de CT. Al mismo tiempo, sintetizamos las transcripciones de ARN diana en números de copia de 103, 104, 105, 106 y 107. Estos ARNm sintetizados se procesaron usando el mismo procedimiento que las transcripciones mencionadas anteriormente (20 µl de ARNm a 60 µl de ADNc y 2 µl de cDNA a 20 µl sistema PCR). Estos ARNm sintetizados produjeron una curva estándar, y pudimos calcular el número de copias del ARNm objetivo haciendo coincidir el valor de CT con la curva estándar.

El análisis inicial de las características clínicas de la población incluida en este estudio se procesó mediante SPSS 21.0 (IBM Corporation, Armonk, Nueva York, EE. UU.). Los datos de medición se probaron para la normalidad y la prueba de homogeneidad de varianza, y las muestras independientes que cumplieron con la distribución normal y se probaron mediante la prueba t en diseño de grupo (se utilizó la prueba t' para la no homogeneidad de la varianza), y la prueba U de Mann-Whitney fue utilizados si no cumplían con la distribución normal; los datos pareados se probaron para determinar la normalidad de la diferencia de medias, usando la prueba t pareada para distribución normal y la prueba de rango con signo de Wilcoxon para no normalidad. Se usó la prueba de chi-cuadrado o la prueba de probabilidad exacta de Fisher para los datos de conteo.

Los resultados experimentales, como el análisis comparativo de la expresión génica, el análisis unidireccional para la representación gráfica y el cálculo del valor p, se realizaron con GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). La puntuación Z (z = (x − μ)/σ; μ = promedio (); σ = stdevp()) se aplicó en el preprocesamiento de datos para normalizar los datos. Se utilizó el software MedCalc 18.0 (MedCalc Software, Ostende, Bélgica) para establecer un modelo de diagnóstico clínico mediante regresión logística y se calculó el área bajo la curva (AUC), la sensibilidad y la especificidad. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a p < 0,05. Los valores del área bajo la curva ROC oscilaron entre 0,5 y 1, con valor diagnóstico bajo entre 0,5 y 0,7, valor diagnóstico moderado entre 0,7 y 0,9 y valor diagnóstico alto por encima de 0,9.

Los conjuntos de datos clínicos analizados durante el estudio actual se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios, y los datos de secuenciación de ARN exosomal están disponibles previa solicitud razonable al Archivo de secuencias de CNGB (CNSA: https://db.cngb.org/cnsa /) de CNGBdb con número de acceso CNP0002099.

angiomiolipoma

Área bajo la curva

Carcinoma de células renales de células claras

Tomografía computarizada

ARNm exosomal

ARN exosomales

Imagen de resonancia magnética

Análisis de seguimiento de nanopartículas

Reacción en cadena de la polimerasa

Característica del operador del receptor

Pequeñas masas renales

Microscopio de transmisión por electrones

mancha occidental

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No aplica.

Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC) (81902616 a FW), el Programa Shuguang de la Fundación para el Desarrollo de la Educación de Shanghái y la Comisión Municipal de Educación de Shanghái (16SG33 a HY), y el proyecto de apoyo a la ciencia y la tecnología en el campo de la biomedicina del plan de acción de ciencia y tecnología de Shanghai (19441909200, FW).

Xing He, Feng Tian, Fei Guo, Fangxing Zhang y Huiyong Zhang contribuyeron por igual a este trabajo.

Departamento de Urología, Hospital Changhai, Universidad Médica Naval (Segunda Universidad Médica Militar), 168 Changhai Road, Shanghái, 200433, China

Xing He, Fei Guo, Jin Ji, Lin Zhao, Jingyi He, Yutian Xiao, Bo Yang y Huamao Ye

Departamento de Urología, The Eighth People's Hospital of Shanghai, 8 Caobao Road, Shanghai, 200235, China

Feng Tian y Feng Zhang

Centro de Medicina Genómica y Personalizada, Laboratorio Clave de Guangxi para Medicina Genómica y Personalizada, Centro de Innovación Colaborativa de Guangxi para Medicina Genómica y Personalizada, Universidad Médica de Guangxi, 22 Shuangyong Road, Nanning, 530021, Guangxi, China

Fangxing Zhang, Huiyong Zhang, Longman Li, Chunmeng Wei, Caihong Huang, Yexin Li y Fubo Wang

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Concepción y diseño: XH, FW, HY y BY; realización de los experimentos: XH, FG y FZ2 (Feng Zhang); adquisición de datos clínicos: FT, HZ, JJ y FZ; recogida de muestras clínicas y procesamiento de muestras: JH, LZ y JJ; análisis e interpretación de datos: FW, FT, FG, FZ1 (Fangxing Zhang), HZ, YX, LL, CW y CH; redacción del manuscrito: XH, FZ1 (Fangxing Zhang) e YL; revisó y editó el manuscrito: FW, HY, BY y FT; supervisión del estudio: FW, HY y BY. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Bo Yang, Huamao Ye o Fubo Wang.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Clínica del Hospital Shanghai Changhai (no. CHEC2020-112). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los participantes.

Consentimiento para publicación

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Figura S1. Control de calidad del aislamiento y verificación de exosomas. Fig. S2. Detección y análisis de ARN exosomal circulante. Figura S3. El rendimiento de los ARNm candidatos para la detección de pacientes con carcinoma de células renales de células claras localizado (ccRCC) de controles sanos y la diferenciación de ccRCC de pacientes con masas renales benignas. Figura S4. AUC de la firma derivada para distinguir ccRCC de controles sanos para ccRCC frente a masas renales benignas (AUC = 0,559).

Tabla S1. Características demográficas y clínicas de los participantes con masas sólidas y quísticas benignas. Tabla S2. Lista de cebadores y sondas. Tabla S3. Lista de transcritos exosómicos desregulados circulantes entre pacientes con carcinoma de células renales de células claras (ccRCC) y controles sanos.

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Reimpresiones y permisos

Él, X., Tian, F., Guo, F. et al. Firmas de ARNm exosómico circulante para el diagnóstico precoz del carcinoma de células renales de células claras. BMC Med 20, 270 (2022). https://doi.org/10.1186/s12916-022-02467-1

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Recibido: 23 de marzo de 2022

Aceptado: 04 julio 2022

Publicado: 25 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-022-02467-1

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